外显子测序分析中使用区间文件INTERVAL

在外显子测序分析过程中，因为测序只针对外显子区域，因此，我们就当只分析外显子区域，这就需要引入一个表示外显子区域的INTERVAL文件，既可加快分析速度，也可以降低OFF-TARGET，那么，在什么步骤引入INTERVAL合适呢？关于这个问题，可以参见GATK的官方说明：When should I restrict my analysis to specific intervals?

关于引入INTERVAL文件，官方文档给出4个理由：

1、针对子集进行快速分析，常常用于排队故障；
2、并行进行跨基因组分析；
3、排除数据质量低的区域；
4、数据集只针对某个特定区域。

对于全基因组测序，没有必要使用INTERVAL文件，但是如果使用，可以排队困难区域以及进行并行处理（拆分成多个区域以进行并行处理，提高分析速度）

对于外显子组测序，必须使用INTERVAL文件，而且需要对两端进行扩展，一般两端各扩展100 bp即可，这可以减少脱靶，并进行并行处理，也可以提高分析速度

那么，何时引入INTERVAL文件呢？对于外显子组测序，特别是BQSR必须限制区域以消除脱靶，因为内含子区域是无信息的，是背景噪音。

另外，使用什么INTERVAL文件呢？官方文档的建议是根据建库的KIT来选择，比如AGILENT，可以从官网下载，对于一个确定的KIT，会提供5个文件：

total 586M
-rwxrwxrwx 1 eric eric 232M Nov 22 17:03 S04380110_AllTracks.bed
-rwxrwxrwx 1 eric eric 116M Nov 22 17:03 S04380110_Covered.bed
-rwxrwxrwx 1 eric eric 116M Nov 22 17:03 S04380110_Padded.bed
-rwxrwxrwx 1 eric eric 116M Nov 22 17:03 S04380110_Regions.bed
-rwxrwxrwx 1 eric eric 6.6M Nov 22 17:03 S04380110_Targets.txt

其中，4个BED文档提供的信息是不同的，我们需要使用的是Padded.bed，原因在于，这个文件是在covered.bed或regions.bed的基础上向两边扩展100bp的，当然，也可以使用未PADDING的BED文件作INTERVAL，因为GATK提供的工具里有interval padding参数，可以在这里指定100 bp的PADDING。

另外，需要注意的是，如果使用了INTERVAL，那么指定区间以外的区域就不会出现在输出文件中了，比如BAM或者VCF文件，这无疑也会使得文件占用空间变小，同时区域以外的数据就丢失了。