第一代测序技术称作sanger sequencing，第二代测序技术（Second-generation sequencing），或下一代测序技术（Next-generation sequencing，NGS），或称作高通量测序，是诸多第二代测序技术的统称，主要技术有三种，即Illumina(Solexa)，Roche 454，Ion Torrent。
一、Illumina(Solexa) sequencing
Illumina测序，是一种边合成边测序的技术，使用荧光信号来标记不同的碱基，因此，可以同时识别数以亿计的碱基。如下图所示，Illumina测序的过程就是个PCR的过程，每个反应添加一个荧光标记的ddNTPs，并读取荧光信号，由于ddNTPs会终止链式反应，因此，新链的合成是同步等长的；而且，这种终止是可逆的（reversible termination），ddNTP在酶的作用下转化为dNTP并启动下一个反应，每个反应需要耗时数分钟。
Illumina测序也可能会引入测序错误，例如，当某些序列在反应中由于没有ddNTP的加入而被读取两次，或者反应液中的dNTP取代ddNTP与模板结合，都会导致测序出错。
在Illumina测序中，由于读长取决于测序的循环数，因此，所有序列的读长都是一致的，一般的读长为100-150bp。
二、Roche 454 sequencing
在454测序中，DNA末端加上Generic adaptors后与beads连接，每个beads对应一个DNA片段，并进行PCR扩增，之后，每个beads放入一个single well中，并进行测序。
与Illumina不同的是，454采用的是光信号而非荧光信号，具体来讲，每个PCR反应只加入一种dNTP，以dGTP为例，若与模板结合，则会放出光信号，若有两个连续的GG结合，则会放出更强的光信号，之后，dGTP被洗脱，再进行下一个dCTP的循环，之后是dATP,dTTP，如此反复。光信号的强度经计算机转换后就成为碱基在对应位置的数目。
与Illumina相比，454的读长可以更长，可以长达1000bp。另外，由于每个循环在不同序列上加入的碱基数不同，因此，454得到的读长是不一致的。
三、Ion Torrent: Proton / PGM sequencing
Ion Torrent的测序原理与454很相似，唯一的不同是，Ion Torrent不检测光信号，而是检测PH，因为当dNTP与模板结合后，会释放出一个H+，进而导致溶液的PH降低，而PH的变化程度则用于确定在该循环中有多少碱基被加入。
Ion Torrent的读长是200bp，而且，与454一样，读长也是不一致的。
